In dit tweede deel wordt Larry Daley weer geconfronteerd met museumstukken die tot leven komen, ditmaal in het Washington Museum
De pret begint wanneer Larry zijn slecht betaalde baan als museumbewaker opgeeft en een succesvolle bedenker wordt van infomercialproducten voor Daley Devices. Alles lijkt hem voor de wind te gaan, maar er ontbreekt iets in zijn leven. Hij gaat terug naar het Natural History Museum, waar hij ooit de meest magische nacht van zijn leven had. Daar komt hij tot een verontrustende ontdekking. Zijn favoriete tentoonstellingen, waaronder die van zijn beste vrienden, staan ingepakt in kratten om naar de enorme archieven van het Smithsonian te worden verbannen. Hun lot is onbekend, totdat Larry een wanhopig telefoontje krijgt van de miniatuurcowboy Jedediah (Owen Wilson), die hem vertelt over een ramp die staat te gebeuren. De recent aangekochte kunstwerken hebben hun nieuwe onderkomen tot leven gewekt. Nu is Kahmunrah van plan om samen met drie handlangers, namelijk de beruchtste heersers uit de geschiedenis - Iwan de Verschrikkelijke (Christopher Guest), Napoleon (Alain Chabat) en Al Capone (Jon Bernthal) - het museum en uiteindelijk de hele wereld over te nemen met hun Leger van de Onderwereld.